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科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

更新時間:2023-01-03瀏覽:1518次

   聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前,PCR成為分子生物學(xué)研究的一部分。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析的方法。該項技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、絕對定量和定性分析,提高了普通PCR技術(shù)的特異性和準(zhǔn)確性,被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。

  一、常規(guī)PCR
  利用DNA分子會在體外95°高溫時會發(fā)生變性解旋變成單鏈,然后降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按堿基互補配對原則結(jié)合,接著再升高溫度到72°C左右,即DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度,DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成相應(yīng)的互補鏈,如此循環(huán)往復(fù)以達(dá)到DNA分子擴增的目的,常規(guī)PCR技術(shù)無法實現(xiàn)精確定量。
  二、實時熒光定量PCR
  如要對DNA、RNA樣品進(jìn)行精確定量研究,就需要采用實時熒光定量PCR,根據(jù)檢測實時熒光PCR產(chǎn)物的方式不同,實時熒光定量PCR主要有DNA結(jié)合染料法、基于探針的化學(xué)法、淬滅染料引物法等類型。
  1.DNA結(jié)合染料法
  原理:應(yīng)用一種帶有熒光的、非特異的DNA結(jié)合染料檢測PCR過程中積累的擴增產(chǎn)物。
  應(yīng)用于核算定量和基因表達(dá)驗證。
  優(yōu)缺點:它們的優(yōu)點是可以對任何雙鏈DNA進(jìn)行定量,不需要探針,具有相對高的靈敏度和可靠性,并且成本低,簡單易用,缺點是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有的DNA雙鏈,其中包括在PCR過程中產(chǎn)生的引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物。
  染料法一般使用的是SYBR Green I染料,這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料,不會與單鏈DNA結(jié)合,并且在游離狀態(tài)下幾乎無熒光,只有與雙鏈DNA結(jié)合才會發(fā)出熒光,因此將PCR擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強度直接關(guān)聯(lián),產(chǎn)生實時監(jiān)測的效果。
  2.基于探針的化學(xué)法
  原理:應(yīng)用一個或多個熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物;依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產(chǎn)物。
  應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。
  優(yōu)缺點:探針法的鑒別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DNA結(jié)合染料法,因為它們只與目的產(chǎn)物結(jié)合,從不與引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物結(jié)合,缺點是它的合成價格高。
  探針法中常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端,而淬滅基團(tuán)則在3’末端,PCR擴增時在加入引物的同時加入探針,探針完整時,熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,PCR擴增時,5’→3’外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而檢測器可以接收到熒光信號。
  3.淬滅染料引物法
  原理:采用熒光標(biāo)記引物擴增,從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴增產(chǎn)物中,依賴熒光能量共振傳遞。
  應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR
  優(yōu)缺點:探針和目標(biāo)片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號,因此減少了背景熒光和假陽性,還可進(jìn)行多重PCR擴增,缺點是原料成本價格高
  三、實時熒光PCR儀
  實時熒光PCR系統(tǒng)包括熱循環(huán)儀,用于熒光激發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)以及用于收集熒光數(shù)據(jù)和管理分析的計算機軟件,數(shù)據(jù)通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。

 

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